Dia 7

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En el día de hoy, realizamos un control de micoplasma a las líneas celulares. Los micoplasmas (Mycoplasma) son un género de bacterias que carecen de pared celular y se encuentran frecuentemente en los laboratorios de investigación como contaminantes de cultivos celulares. La contaminación se produce a través de las personas que manipulan los cultivos celulares o debido a medios de cultivo contaminados. La célula de un Mycoplasma mide generalmente menos de 1 μm y son, por lo tanto, difíciles de detectar con un microscopio convencional. Los micoplasmas pueden inducir cambios celulares, como cambios en el metabolismo y el crecimiento celular, e infecciones graves pueden destruir una línea celular.
Para el ensayo de hoy se siembraron la células sobre cubreobjetos, colocados en una caja de petri, en su medio habitual y se incubaron a 37°C en estufa gaseada 5% CO2 en aire, hasta alcanzar una confuenza aproximada del 70%. A continuación detallaremos el procedimiento que realizamos.

• Hacer 3 lavados con PBS.
• Fijar los preparados durante 5 minutos con fijador Carnoy recién preparado (metanol: ácido acético glacial, 3:1)
• Descartar el fijador y dejar secar los preparados al aire (puede ser conservado a -70°C si no se desea colorear inmediatamente)
• Colorear durante 30 minutos en oscuridad con Dapi, 1/2000, el cual es específico para ADN
• Hacer 3 lavados con PBS y dejar secar
• Montar los preparados invertidos sobre portaojetos con una mezcla de PBS/glicerina en relación 1:1 y observar inmediatamente con microscopio de fluorescencia

IMPORTANTE: las soluciones de trabajo deben estar estériles.

Resultados:

El DAPI es un colorante fluorescente que se intercala en el ADN. Este fluorocromo colorea de azul los cromosomas cuando se los ilumina con luz UV, por lo tanto, un resultado

• Negativo: solo se observa el núcleo de las células fijadas.
• Positivo: se observa el núcleo de las células fijadas y el DNA del micoplasma que se observa como un puntilleado en el citoplasma, debido a que dichas bacterias infectan el citoplasma de las células en cultivo.

Las siguientes imágenes muestran lo visto en el microscopio de líneas de células estudiadas que dieron positivas de diferentes cultivos contaminados, los puntos que rodean al núcleo son los micoplasmas.