Día 6

18/06

A continuación los resultados del Western Blot de la semana pasada:

Primer anticuerpo utilizado:
1- NOS-2 (Oxido Nítrico Sintasa – 2 / Inducible), hecho en conejo, 1:800
2- VEGF-A (Factor de crecimiento de endotelio vascular - A), hecho en cabra, 1:100
3 y 4 - MMP-9 (Metaloproteasa – 9), hecho en cabra, 1:100

Segundo anticuerpo utilizado:
1- Anticuerpo policlonal contra IgG de conejo 1:20000
2, 3 y 4 – Anticuerpo policlonal contra IgG de cabra 1:40000


Tratamientos:
M: Marcador molecular
B: Basal (macrófagos sin tratamiento)
LPS: Macrófagos tratados con 100mg/ml LPS durante 24hs.
P: 15d Prostaglandina J durante 30 minutos
P+L: 15d Prostaglandina J durante 30 minutos + LPS durante 24hs.
MG: MG-132, inhibidor de NF-kB durante 30 minutos
MG + L: MG-132, inhibidor de NF-kB durante 30 minutos + LPS durante 24hs.

En la membrana, las últimas 3 calles, se sembraron B, LPS y MG+L, y se utilizó como control. Es decir, no se colocó el primer anticuerpo, y si el segundo.

Las muestras sembradas en las membranas 1 y 4, son lisados de macrófagos obtenidos el día 21/05/09. Las sembradas en las membranas 2 y 3, son los sobrenadantes de dichos macrófagos.

En la membrana 1, observamos que el tratamiento con LPS, estimula los macrófagos, e indujo la expresión de NOS-2.
El tratamiento con Prostaglandina J, redujo parcialmente la expresión de NOS-2 en los macrófagos tratados con LPS. En cambio, el tratamiento con MG-132, inhibió completamente la expresión de dicha proteína. Constatamos que los inhibidores por si solos, no modifican la expresión de NOS-2.

En las membranas 2, 3 y 4, a diferencia de lo observado en la membrana 1, no se pudo observar expresión alguna. Esto se puede deber a:
-Que la proteína no se exprese
-Que la expresión de la proteína sea baja y el ensayo no sea lo suficientemente sensible para detectarla
-También observamos que estas membranas, principalmente la 3 y 4, están muy manchadas, lo que podría ser porque el primer anticuerpo se unió inespecíficamente en toda la membrana. Para poder corroborarlo, podríamos aumentar la concentración de leche en la solución de bloqueo.

La membrana 1, que dio la expresión de NOS-2, fue "stripeada", o sea, fue tratada con NaOH 0,2N, durante 5 minutos, y luego enjuagada con agua destilada. De esta forma obtenemos nuevamente la membrana para comenzar otra vez el ensayo a partir de la hora de bloqueo. Esta segunda vez, la membrana fue incubada toda la noche con un anticuerpo contra CD40, que es considerado un marcador inflamatorio. En el día de hoy comenzamos los lavados con TBS TWEEN, e incubado de 1h con el segundo anticuerpo, el cual es policlonal contra conejo. Transcurrido este tiempo volvemos a lavar, para sacar el exceso del anticuerpo, y revelamos. A continuación mostramos imágenes sobre estas últimas acciones.