Día 4

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Trabajamos con la técnica Westernblot o Inmunotransferencia, la cual se utiliza para determinar la cantidad relativa(a partir de su densidad óptica) y el peso molecular de una proteína en una mezcla de proteínas u otras moléculas.
A continuación los pasos que seguimos para llevar a cabo la práctica.

Preparación de geles para Inmunoblotting:

• Limpiar bien los vidrios

• Gel separador 7,5 % (separa las proteínas de mayor tamaño):
H2Od 4,9 ml
Tris HCL 1,5M pH 8, 8 2,5 ml
SDS 10% 100 ul
Acrilamida / Bis 2,5 ml
Persulfato de amonio 10% 100 ul
TEMED 10 ul

El persulfato de amonio y el TEMED son los que catalizan la reacción permitiendo que melifique la acrilamida.

• Cargar 1ml en la pipeta y depositarlos entre los vidrios llenando hasta donde comenzaría el peine.
• Agregar alcohol o H2Od con pasteur hasta el tope para evitar irregularidades en el gel.
• Esperar entre 15 y 20 minutos para que gelifique. Luego sacamos el alcohol o H2Od.


• Gel concentrador 4,5%:
H2Od 3,05 ml
Tris HCL 0,5M pH 6, 8 1,25 ml
SDS 10% 50 ul
Acrilamida / Bis 0,665 ml
Persulfato de amonio 10% 40 ul
TEMED 4 ul

• Agregar la solución y colocar el peine.
• Esperar otros 15 a 20 minutos para que gelifique.


• Preparación de la muestra:Vol. muestra + 20 % (del Vol. muestra) de mezcla (*Simple buffer + 5% B-M)
Además agregar el marcador.
* Simple buffer es azul de bromo fenol + glicina/glicerol + SDS + βmercapto
El 1ero le da el color, el 2ndo le da mayor densidad, el 3ero la carga negativa y el 4to corta los puentes de disulfuro.
COCINAR 3 MINUTOS A 100º C. Esto provoca una desnaturalización de las proteínas.


• Preparación de la CUBA:
- Colocar los geles.
- Agregar buffer de corrida.
- Sacar el peine y sembrar.
- Conectar la fuente: Gel concentrador 80 V (hasta el Gel separador)
Amp 0, 04
Gel separador 100 V (hasta el borde inferior).


• Preparación del buffer de transferencia:
- Preparar los recipientes para que se humedezca las membranas y el papel, ambas paradas durante 15 minutos.
• Terminada la corrida, sacar los geles, separar los vidrios y cortar el peine con la espátula.
• Colocar los geles en el buffer de transferencia, para que se hidraten, 20 minutos.