Día 5

11/6

En el día de hoy continuamos con el práctico de la semana pasada.
A continuación los pasos que seguimos:

• Preparar la unidad de transferencia:
- Colocar: PAPEL, NITROCELULOSA, GEL, PAPEL. (embebidos en el buffer de trasferencia)
- Ir pasando con una varilla de vidrio como guía.
- Conectar la fuente a 100 V y dejar por una hora.
• Cortar la membrana y marcarla.
• Teñir con Rojo Pinzo 1 minuto y lavar con H2O(d) y TBS varias veces.
• En cubetas colocar TBS Tween 20 0,05% 5% leche y poner en agitación durante una hora a temperatura ambiente.
• Las membranas se colocan en bolsitas.
• Agregar con micropipeta el 1er Ac (1:100) en TBS Tween 20 0,05% 5% leche, apretar para que salgan las burbujas.
• Colocar en aparato giratorio en cámara fría over night.

• Culminación del Inmunoblotting:
• Sacar la membrana de la bolsa.
• Hacer 3 lavados de 5 minutos TBS-Tween 20, con agitación a temperatura ambiente.
• Hacer 1 lavado de 10 minutos TBS-Tween 20, con agitación a temperatura ambiente.
• Preparar el 2do Ac (1:4000) en TBS Tween 20 0,05% 5% leche.
• Colocar en cubetas y poner en estufa a 37º C y agitar por una hora.
• Sacar las cubetas a temperatura ambiente y con agitación hacer:
• 3 lavados de 10 minutos TBS Tween 20.
• 1 lavado de 10 minutos TBS.

• Revelar por ECL
Cosas necesarias:
- Timer
- Papel de diario
- Pinza
- Cassette
- Papel absorbente
- Tips azules y amarillos
- Pipeta p1000 y p20
- Solución A ECL
- Solución B ECL
- Revelador
- Probeta de 100ml
- Fijador diluido
- Bateas (3)
- Placas radiográficas
- Folio
- Tijera
- Marcador
- Membranas de nitrocelulosa
- Guantes

• Ir al cuarto oscuro con todo.
• Tirar el TBS y secar el excedente con papel absorbente.
• Colocar sobre las membranas de nitrocelulosa la solución A+B (1 ml A + 1 ml B)
• Dejar no más de 5 minutos.
• Sacar y secar el excedente de la solución A+B.
• Colocar la membrana de nitro en el folio dentro del cassette, sacar burbujas.

APAGAR LA LUZ
• Sacar placa radiográfica y cortar una punta para orientación.
• Colocar sobre la membrana y folio.
• Cerrar el cassette, colocarlo dentro de una bolsa negra para evitar que entre luz, esperando el tiempo necesario de exposición.
• Colocar la placa radiográfica en la batea con revelador (se hace en el momento: 10 ml revelador + 80 ml H2O corriente) aproximadamente un minuto hasta que aparezcan bandas.
• Pasar la placa radiográfica a la batea con fijador aproximadamente un minuto (Fijador 1:4 H2O corriente).
• Pasar la placa radiográfica a la batea con H2O corriente.
• Prender luz.
• Enjuagar y dejar secar.

ACLARACIÓN: si bien hubo pasos que no llegamos a hacer se nos explicó teoricamente como proceder y se nos informará de los resultados el próximo jueves.