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viernes, 29 de mayo de 2009
jueves, 28 de mayo de 2009
Dia 3
28/5
DETERMINACIÓN DE PROTEÍNAS POR EL MÉTODO DE BRADFORD
En este día, utilizamos el método Bradford para determinar proteínas de diferentes muestras obtenidas.
El método de Bradford es una técnica colorimétrica basada en la capacidad que tienen las proteínas para unirse a ciertos colorantes.
El método de Bradford fue diseñado, como su nombre lo indica, por Bradford en 1976. El mismo se definió como sencillo, barato (solo se necesita un colorante), sensible (1-100mg) y rápido (la reacción finaliza a los 5 minutos y es estable por una hora). La absorbancia se lee a 595nm.
Blanco: Este tubo no contiene proteína, se reemplaza la muestra por agua y se le agrega el correspondiente volumen de reactivo. Se realiza para determinar la absorbancia del reactivo, este valor se descuenta de la absorbancia del resto de los tubos.
Curva de calibración: Para su realización se utilizará la solución testigo de Albúmina bovina de concentración conocida, 1 mg/ml. Con la medida de absorbancia de cada tubo y conociendo la cantidad de proteínas que contiene cada uno de los tubos, es posible realizar una curva de calibración (gráfico A595 vs mg de proteína). Es necesario realizarla cada vez que se procesen las muestras.
Muestra incógnita: se procesa en simultáneo y en las mismas condiciones que la curva de calibración. El tubo contiene la muestra y la misma cantidad de reactivos que los anteriores. Para conocer la cantidad de proteínas de la muestra (mg), se determina la absorbancia de la misma y se interpola en la curva de calibración.
La curva la realizamos tomando de 2,5 a 40 ml de la solución madre o testigo y luego la llevamos a 50 ml con H2Od. De las muestras colocamos 10 ml y los llevamos a 50 ml, siempre con H2Od. Finalmente a todos los tubos, se les agregó 950 ml del reactivo de Bradford.
El método de Bradford es una técnica colorimétrica basada en la capacidad que tienen las proteínas para unirse a ciertos colorantes.
El método de Bradford fue diseñado, como su nombre lo indica, por Bradford en 1976. El mismo se definió como sencillo, barato (solo se necesita un colorante), sensible (1-100mg) y rápido (la reacción finaliza a los 5 minutos y es estable por una hora). La absorbancia se lee a 595nm.
Blanco: Este tubo no contiene proteína, se reemplaza la muestra por agua y se le agrega el correspondiente volumen de reactivo. Se realiza para determinar la absorbancia del reactivo, este valor se descuenta de la absorbancia del resto de los tubos.
Curva de calibración: Para su realización se utilizará la solución testigo de Albúmina bovina de concentración conocida, 1 mg/ml. Con la medida de absorbancia de cada tubo y conociendo la cantidad de proteínas que contiene cada uno de los tubos, es posible realizar una curva de calibración (gráfico A595 vs mg de proteína). Es necesario realizarla cada vez que se procesen las muestras.
Muestra incógnita: se procesa en simultáneo y en las mismas condiciones que la curva de calibración. El tubo contiene la muestra y la misma cantidad de reactivos que los anteriores. Para conocer la cantidad de proteínas de la muestra (mg), se determina la absorbancia de la misma y se interpola en la curva de calibración.
La curva la realizamos tomando de 2,5 a 40 ml de la solución madre o testigo y luego la llevamos a 50 ml con H2Od. De las muestras colocamos 10 ml y los llevamos a 50 ml, siempre con H2Od. Finalmente a todos los tubos, se les agregó 950 ml del reactivo de Bradford.
jueves, 21 de mayo de 2009
Dia 2
21/05
En este segundo día, el objetivo fue extraer macrófagos peritoneales de ratones de la cepa Balb/c. Para esto, preparamos medio de cultivo denominado F12 al 10 % de suero fetal bovino. Una vez sacrificado el ratón, se le inyecta 5ml del medio de cultivo en forma intraperitoneal (i.p.). Luego se extrae de nuevo el medio de cultivo recuperando suspensiones celulares que se dejaron adherir al plástico en placas de Petri durante 2 h. a 37°C. Una vez trascurrido ese tiempo se realizan dos lavados con PBS, las células adheridas (macrófagos) se trataron con lipopolisacárido de E. Coli en una concentración de 100 ug/ml durante 24 hs. Al otro día, se obtuvieron los sobrenadantes de cultivo y lisados celulares, de los cuales se dejo una alícuota para medir proteína por Bradford.
La imagen de arriba muestra los ratones utilizados mientras que la que se encuentra a continuación es un pequeño cuadro para entender un poco mejor lo recién explicado.
La imagen de arriba muestra los ratones utilizados mientras que la que se encuentra a continuación es un pequeño cuadro para entender un poco mejor lo recién explicado.
miércoles, 20 de mayo de 2009
Dia 1
14/5
Iniciamos la pasantía leyendo sobre los temas que integran nuestro proyecto para poder entender mejor en que consiste y hablando sobre éste con la investigadora a quien respondemos Eulalia De La Torre.
A continuación encontrarán un resumen de lo leído:
Primera clase cor
Iniciamos la pasantía leyendo sobre los temas que integran nuestro proyecto para poder entender mejor en que consiste y hablando sobre éste con la investigadora a quien respondemos Eulalia De La Torre.
A continuación encontrarán un resumen de lo leído:
Primera clase cor
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