Dia 7

25/6

En el día de hoy, realizamos un control de micoplasma a las líneas celulares. Los micoplasmas (Mycoplasma) son un género de bacterias que carecen de pared celular y se encuentran frecuentemente en los laboratorios de investigación como contaminantes de cultivos celulares. La contaminación se produce a través de las personas que manipulan los cultivos celulares o debido a medios de cultivo contaminados. La célula de un Mycoplasma mide generalmente menos de 1 μm y son, por lo tanto, difíciles de detectar con un microscopio convencional. Los micoplasmas pueden inducir cambios celulares, como cambios en el metabolismo y el crecimiento celular, e infecciones graves pueden destruir una línea celular.
Para el ensayo de hoy se siembraron la células sobre cubreobjetos, colocados en una caja de petri, en su medio habitual y se incubaron a 37°C en estufa gaseada 5% CO2 en aire, hasta alcanzar una confuenza aproximada del 70%. A continuación detallaremos el procedimiento que realizamos.

• Hacer 3 lavados con PBS.
• Fijar los preparados durante 5 minutos con fijador Carnoy recién preparado (metanol: ácido acético glacial, 3:1)
• Descartar el fijador y dejar secar los preparados al aire (puede ser conservado a -70°C si no se desea colorear inmediatamente)
• Colorear durante 30 minutos en oscuridad con Dapi, 1/2000, el cual es específico para ADN
• Hacer 3 lavados con PBS y dejar secar
• Montar los preparados invertidos sobre portaojetos con una mezcla de PBS/glicerina en relación 1:1 y observar inmediatamente con microscopio de fluorescencia

IMPORTANTE: las soluciones de trabajo deben estar estériles.

Resultados:

El DAPI es un colorante fluorescente que se intercala en el ADN. Este fluorocromo colorea de azul los cromosomas cuando se los ilumina con luz UV, por lo tanto, un resultado

• Negativo: solo se observa el núcleo de las células fijadas.
• Positivo: se observa el núcleo de las células fijadas y el DNA del micoplasma que se observa como un puntilleado en el citoplasma, debido a que dichas bacterias infectan el citoplasma de las células en cultivo.

Las siguientes imágenes muestran lo visto en el microscopio de líneas de células estudiadas que dieron positivas de diferentes cultivos contaminados, los puntos que rodean al núcleo son los micoplasmas.

Día 6

18/06

A continuación los resultados del Western Blot de la semana pasada:

Primer anticuerpo utilizado:
1- NOS-2 (Oxido Nítrico Sintasa – 2 / Inducible), hecho en conejo, 1:800
2- VEGF-A (Factor de crecimiento de endotelio vascular - A), hecho en cabra, 1:100
3 y 4 - MMP-9 (Metaloproteasa – 9), hecho en cabra, 1:100

Segundo anticuerpo utilizado:
1- Anticuerpo policlonal contra IgG de conejo 1:20000
2, 3 y 4 – Anticuerpo policlonal contra IgG de cabra 1:40000


Tratamientos:
M: Marcador molecular
B: Basal (macrófagos sin tratamiento)
LPS: Macrófagos tratados con 100mg/ml LPS durante 24hs.
P: 15d Prostaglandina J durante 30 minutos
P+L: 15d Prostaglandina J durante 30 minutos + LPS durante 24hs.
MG: MG-132, inhibidor de NF-kB durante 30 minutos
MG + L: MG-132, inhibidor de NF-kB durante 30 minutos + LPS durante 24hs.

En la membrana, las últimas 3 calles, se sembraron B, LPS y MG+L, y se utilizó como control. Es decir, no se colocó el primer anticuerpo, y si el segundo.

Las muestras sembradas en las membranas 1 y 4, son lisados de macrófagos obtenidos el día 21/05/09. Las sembradas en las membranas 2 y 3, son los sobrenadantes de dichos macrófagos.

En la membrana 1, observamos que el tratamiento con LPS, estimula los macrófagos, e indujo la expresión de NOS-2.
El tratamiento con Prostaglandina J, redujo parcialmente la expresión de NOS-2 en los macrófagos tratados con LPS. En cambio, el tratamiento con MG-132, inhibió completamente la expresión de dicha proteína. Constatamos que los inhibidores por si solos, no modifican la expresión de NOS-2.

En las membranas 2, 3 y 4, a diferencia de lo observado en la membrana 1, no se pudo observar expresión alguna. Esto se puede deber a:
-Que la proteína no se exprese
-Que la expresión de la proteína sea baja y el ensayo no sea lo suficientemente sensible para detectarla
-También observamos que estas membranas, principalmente la 3 y 4, están muy manchadas, lo que podría ser porque el primer anticuerpo se unió inespecíficamente en toda la membrana. Para poder corroborarlo, podríamos aumentar la concentración de leche en la solución de bloqueo.

La membrana 1, que dio la expresión de NOS-2, fue "stripeada", o sea, fue tratada con NaOH 0,2N, durante 5 minutos, y luego enjuagada con agua destilada. De esta forma obtenemos nuevamente la membrana para comenzar otra vez el ensayo a partir de la hora de bloqueo. Esta segunda vez, la membrana fue incubada toda la noche con un anticuerpo contra CD40, que es considerado un marcador inflamatorio. En el día de hoy comenzamos los lavados con TBS TWEEN, e incubado de 1h con el segundo anticuerpo, el cual es policlonal contra conejo. Transcurrido este tiempo volvemos a lavar, para sacar el exceso del anticuerpo, y revelamos. A continuación mostramos imágenes sobre estas últimas acciones.

Día 5

11/6

En el día de hoy continuamos con el práctico de la semana pasada.
A continuación los pasos que seguimos:

• Preparar la unidad de transferencia:
- Colocar: PAPEL, NITROCELULOSA, GEL, PAPEL. (embebidos en el buffer de trasferencia)
- Ir pasando con una varilla de vidrio como guía.
- Conectar la fuente a 100 V y dejar por una hora.
• Cortar la membrana y marcarla.
• Teñir con Rojo Pinzo 1 minuto y lavar con H2O(d) y TBS varias veces.
• En cubetas colocar TBS Tween 20 0,05% 5% leche y poner en agitación durante una hora a temperatura ambiente.
• Las membranas se colocan en bolsitas.
• Agregar con micropipeta el 1er Ac (1:100) en TBS Tween 20 0,05% 5% leche, apretar para que salgan las burbujas.
• Colocar en aparato giratorio en cámara fría over night.

• Culminación del Inmunoblotting:
• Sacar la membrana de la bolsa.
• Hacer 3 lavados de 5 minutos TBS-Tween 20, con agitación a temperatura ambiente.
• Hacer 1 lavado de 10 minutos TBS-Tween 20, con agitación a temperatura ambiente.
• Preparar el 2do Ac (1:4000) en TBS Tween 20 0,05% 5% leche.
• Colocar en cubetas y poner en estufa a 37º C y agitar por una hora.
• Sacar las cubetas a temperatura ambiente y con agitación hacer:
• 3 lavados de 10 minutos TBS Tween 20.
• 1 lavado de 10 minutos TBS.

• Revelar por ECL
Cosas necesarias:
- Timer
- Papel de diario
- Pinza
- Cassette
- Papel absorbente
- Tips azules y amarillos
- Pipeta p1000 y p20
- Solución A ECL
- Solución B ECL
- Revelador
- Probeta de 100ml
- Fijador diluido
- Bateas (3)
- Placas radiográficas
- Folio
- Tijera
- Marcador
- Membranas de nitrocelulosa
- Guantes

• Ir al cuarto oscuro con todo.
• Tirar el TBS y secar el excedente con papel absorbente.
• Colocar sobre las membranas de nitrocelulosa la solución A+B (1 ml A + 1 ml B)
• Dejar no más de 5 minutos.
• Sacar y secar el excedente de la solución A+B.
• Colocar la membrana de nitro en el folio dentro del cassette, sacar burbujas.

APAGAR LA LUZ
• Sacar placa radiográfica y cortar una punta para orientación.
• Colocar sobre la membrana y folio.
• Cerrar el cassette, colocarlo dentro de una bolsa negra para evitar que entre luz, esperando el tiempo necesario de exposición.
• Colocar la placa radiográfica en la batea con revelador (se hace en el momento: 10 ml revelador + 80 ml H2O corriente) aproximadamente un minuto hasta que aparezcan bandas.
• Pasar la placa radiográfica a la batea con fijador aproximadamente un minuto (Fijador 1:4 H2O corriente).
• Pasar la placa radiográfica a la batea con H2O corriente.
• Prender luz.
• Enjuagar y dejar secar.

ACLARACIÓN: si bien hubo pasos que no llegamos a hacer se nos explicó teoricamente como proceder y se nos informará de los resultados el próximo jueves.

Día 4

4/6

Trabajamos con la técnica Westernblot o Inmunotransferencia, la cual se utiliza para determinar la cantidad relativa(a partir de su densidad óptica) y el peso molecular de una proteína en una mezcla de proteínas u otras moléculas.
A continuación los pasos que seguimos para llevar a cabo la práctica.

Preparación de geles para Inmunoblotting:

• Limpiar bien los vidrios

• Gel separador 7,5 % (separa las proteínas de mayor tamaño):
H2Od 4,9 ml
Tris HCL 1,5M pH 8, 8 2,5 ml
SDS 10% 100 ul
Acrilamida / Bis 2,5 ml
Persulfato de amonio 10% 100 ul
TEMED 10 ul

El persulfato de amonio y el TEMED son los que catalizan la reacción permitiendo que melifique la acrilamida.

• Cargar 1ml en la pipeta y depositarlos entre los vidrios llenando hasta donde comenzaría el peine.
• Agregar alcohol o H2Od con pasteur hasta el tope para evitar irregularidades en el gel.
• Esperar entre 15 y 20 minutos para que gelifique. Luego sacamos el alcohol o H2Od.


• Gel concentrador 4,5%:
H2Od 3,05 ml
Tris HCL 0,5M pH 6, 8 1,25 ml
SDS 10% 50 ul
Acrilamida / Bis 0,665 ml
Persulfato de amonio 10% 40 ul
TEMED 4 ul

• Agregar la solución y colocar el peine.
• Esperar otros 15 a 20 minutos para que gelifique.


• Preparación de la muestra:Vol. muestra + 20 % (del Vol. muestra) de mezcla (*Simple buffer + 5% B-M)
Además agregar el marcador.
* Simple buffer es azul de bromo fenol + glicina/glicerol + SDS + βmercapto
El 1ero le da el color, el 2ndo le da mayor densidad, el 3ero la carga negativa y el 4to corta los puentes de disulfuro.
COCINAR 3 MINUTOS A 100º C. Esto provoca una desnaturalización de las proteínas.


• Preparación de la CUBA:
- Colocar los geles.
- Agregar buffer de corrida.
- Sacar el peine y sembrar.
- Conectar la fuente: Gel concentrador 80 V (hasta el Gel separador)
Amp 0, 04
Gel separador 100 V (hasta el borde inferior).


• Preparación del buffer de transferencia:
- Preparar los recipientes para que se humedezca las membranas y el papel, ambas paradas durante 15 minutos.
• Terminada la corrida, sacar los geles, separar los vidrios y cortar el peine con la espátula.
• Colocar los geles en el buffer de transferencia, para que se hidraten, 20 minutos.