24/09
Inmunohistoquimica
Hoy empezamos con los ensayos de inmunohistoquimica que habiamos nombrado en el día 8. Esa vez la investigadora Eulalia De La Torre había enviado los corazones extraídos de los animales sacrificados al laboratorio de histología para que les realicen diferentes cortes en parafina (de entre 3 a 10 micrometros). En el día de hoy esos cortes ya fueron recibidos y pudimos empezar con los ensayos. Todo el ensayo lo hicimos en campana.
Los tratamientos a estudiar en este ensayo son:
corazon proveniente de un animal normal, corazones provenientes de animales estimulados durante 6 y 24hs con LPS.
El primer paso realizado fue el de rehidratación de los cortes con diferentes concentraciones de alcoholes. Hicimos 2 lavados con xilol, seguidos de 2 con alcohol etílico absoluto, 1 con alcohol 90%, 1 con alcohol 95%, 1 con alcohol 90%, 1 con alcohol 80%, 1 con alcohol 70%, y finalmente 1 con agua destilada. Cada lavado fue de 10 minutos.
Despues agregamos una solución 0,3% de agua oxigenada de 30 volumenes en PBS. Con 20 minutos de acción se logra la inhibición de la peroxidasa endógena.
Lavamos 2 veces con PBS durante 5 minutos y luego lavamos otros 5 minutos con PBS-T.
Lo último que hicimos en este día fue rodear la feta con un marcador llamado PAP pen, para que al 1er anticuerpo quede retenido en el círculo marcado. Entonces pusimos a incubar el 1er anticuerpo en PBS-T, en cámara húmeda y así quedará hasta mañana cuando la investigadora lo retire para seguir con el ensayo, realizando los siguientes pasos:
Lavar 2 veces durante 5 minutos con PBS y luego con PBS-T
Incubar con el 2do anticuerpo biotinilado en suero bloqueante, en cámara húmeda, durante 60 min.
Lavar 2 veces durante 5 minutos con PBS y luego con PBS-T.
Incubar con el 3er anticuerpo biotinilado en suero bloquente, en cámara húmeda, durante 60 min.
Lavar 2 veces durante 5 minutos con PBS.
Visualizar con diaminobencidina 400mg/l en Tris-HCl pH 7.6 + 4 gotas de agua oxigenada durante 10 minutos.
Lavar con agua destilada
Teñir con hematoxilina por 10 segundos (Contraticion)
Lavar con agua durante 10 minutos.
Deshidratar realizando los mismos lavados que al iniciar el ensayo pero en orden contrario.
Montar el porta con Entellan.
La próxima semana nos contará y veremos cuales fueron los resultados.
jueves, 24 de septiembre de 2009
Resultados día 10
24/09
En el día de hoy, también observamos los resultados de la zimografía del jueves pasado. Las imagenes a continuación corresponden al gel corrido.
El ensayo fue exitoso dado que se ven las bandas claras. El LPS estimuló la producción de MMP-9 con respecto al basal. Se puede observar tambien como el MG-132 inhibió esta estimulación. La imagen a continuación es la misma, pero en blanco y negro para poder cuantificar las bandas. Cabe destacar que el peso de las bandas observadas concuerdan con el control positivo (PM de MMP-9: 92 kDa).
En el día de hoy, también observamos los resultados de la zimografía del jueves pasado. Las imagenes a continuación corresponden al gel corrido.
El ensayo fue exitoso dado que se ven las bandas claras. El LPS estimuló la producción de MMP-9 con respecto al basal. Se puede observar tambien como el MG-132 inhibió esta estimulación. La imagen a continuación es la misma, pero en blanco y negro para poder cuantificar las bandas. Cabe destacar que el peso de las bandas observadas concuerdan con el control positivo (PM de MMP-9: 92 kDa).
Cuantificación de las bandas:
Densidad Óptica relativa
Basal - LPS - PGJ - PGJ+LPS - MG-132 - MG-132+LPS
--1 -- 1.53 - 0.43 -- 1.11 ---- 0.28 ------ 0.32jueves, 17 de septiembre de 2009
Día 10
17/9
Cuantificación de la actividad de MMP-9 por zimografía
El día de hoy realizamos una zimografía que es una técnica que permite estudiar la actividad de las metaloproteasas liberadas a un medio de cultivo celular. Se realizaron los geles de poliacrilamida para correr las muestras obtenidas en semanas anteriores. Dichos geles son similares a los que realizamos para Western Blot con la diferencia que se le agrega, al gel separador, gelatina. Una vez corridas las muestras (sobrenadante de macrófago: basal, LPS, PGJ, PGJ+LPS, MG-132, MG-132+LPS y suero de animales con 14 días de portación de tumor que se utilizó como control positivo), al gel se le hicieron lavados primero con PBS más tritón X100 y luego con PBS solo. Finalmente se colocó el gel en el buffer de incubación que contiene TRIS HCl, CaCl2 y agua destilada durante 24 hs. Luego de esto, lo que hicimos nosotras hoy, fue colocar los geles en el buffer de tinción que contiene coomasie blue, metanol, acético y agua durante 2hs a temperatura ambiente. En este paso, el gel quedará teñido completamente de color azul. Finalizado este tiempo, comienzará el desteñido del gel con una solución de acético y etanol durante 2 o 3hs. En el caso de que la muestra tenga MMP-9 se observará el gel teñido de azul con la aparición de bandas incoloras que corresponden a que la MMP-9 degradó la gelatina. Estos resultados los observaremos el jueves próximo.
Cuantificación de la actividad de MMP-9 por zimografía
El día de hoy realizamos una zimografía que es una técnica que permite estudiar la actividad de las metaloproteasas liberadas a un medio de cultivo celular. Se realizaron los geles de poliacrilamida para correr las muestras obtenidas en semanas anteriores. Dichos geles son similares a los que realizamos para Western Blot con la diferencia que se le agrega, al gel separador, gelatina. Una vez corridas las muestras (sobrenadante de macrófago: basal, LPS, PGJ, PGJ+LPS, MG-132, MG-132+LPS y suero de animales con 14 días de portación de tumor que se utilizó como control positivo), al gel se le hicieron lavados primero con PBS más tritón X100 y luego con PBS solo. Finalmente se colocó el gel en el buffer de incubación que contiene TRIS HCl, CaCl2 y agua destilada durante 24 hs. Luego de esto, lo que hicimos nosotras hoy, fue colocar los geles en el buffer de tinción que contiene coomasie blue, metanol, acético y agua durante 2hs a temperatura ambiente. En este paso, el gel quedará teñido completamente de color azul. Finalizado este tiempo, comienzará el desteñido del gel con una solución de acético y etanol durante 2 o 3hs. En el caso de que la muestra tenga MMP-9 se observará el gel teñido de azul con la aparición de bandas incoloras que corresponden a que la MMP-9 degradó la gelatina. Estos resultados los observaremos el jueves próximo.
jueves, 10 de septiembre de 2009
Día 9
10/9
El día de hoy realizamos la técnica de Griess para la medición de nitritos. Para la determinación de óxido nítrico, que es un compuesto que participa durante un shock séptico y que tiene una vida media muy corta, se utiliza la determinación de nitritos en sobrenadantes de cultivos celulares, debido a que éstos son los productos finales estables.
Primero preparamos dos soluciones (A y B). Para la solución A, pesamos 500mg de ác. sulfanílico y lo disolvimos con 35ml de agua destilada y 15 ml de ácido acético. Para lograr su completa disolución, la calentamos a baño maría. La solución B estaba compuesta por 50 mg de naftilendiamina, 30 ml de ácido acético y 20 ml de agua destilada. A partir de éstas, se forma la solución final sumando la misma cantidad de cada solución. Para realizar una curva estandar de nitritos, diluimos una solución madre, dada por nuestra investigadora, de nitrito de sodio 2M. A partir de esta solución realizamos diferentes diluciones a las que, más tarde, les agregamos la solución A+B preparada. Pasados unos minutos, se empezó a ver una col
oración en las diferentes diluciones. Para obtener la curva de calibración, las leimos a 545nm en el lector de ELISA. A la derecha, podrán observar la curva de calibración obtenida.
El día de hoy realizamos la técnica de Griess para la medición de nitritos. Para la determinación de óxido nítrico, que es un compuesto que participa durante un shock séptico y que tiene una vida media muy corta, se utiliza la determinación de nitritos en sobrenadantes de cultivos celulares, debido a que éstos son los productos finales estables.
Primero preparamos dos soluciones (A y B). Para la solución A, pesamos 500mg de ác. sulfanílico y lo disolvimos con 35ml de agua destilada y 15 ml de ácido acético. Para lograr su completa disolución, la calentamos a baño maría. La solución B estaba compuesta por 50 mg de naftilendiamina, 30 ml de ácido acético y 20 ml de agua destilada. A partir de éstas, se forma la solución final sumando la misma cantidad de cada solución. Para realizar una curva estandar de nitritos, diluimos una solución madre, dada por nuestra investigadora, de nitrito de sodio 2M. A partir de esta solución realizamos diferentes diluciones a las que, más tarde, les agregamos la solución A+B preparada. Pasados unos minutos, se empezó a ver una col
oración en las diferentes diluciones. Para obtener la curva de calibración, las leimos a 545nm en el lector de ELISA. A la derecha, podrán observar la curva de calibración obtenida.Paralelamente, aplicamos el mismo procedimiento a muestras obtenidas con distintos tratamientos. Abajo se podrá observar un gráfico con la concentración de nitritos en cada uno de los tratamientos.
Como resultados observamos que el tratamiento de los macrófagos con LPS estimula significativamente la producción de nitritos, cuyo efecto depende del NF-kB (factor de trascripción) debido a que el pre-tratamiento con prostaglandina J (PGJ) y MG-132 bloquea dicho estimulo. Cabe recordar que PGJ y MG-132 son inhibidores de NF-kB.
jueves, 3 de septiembre de 2009
Día 8
3/9
Luego del prolongado receso, hoy, volvimos a extraer macrófagos peritoneales de un ensayo que consistía en inyectar LPS 0,1 mg/0,1ml de PBS, de forma interperitoneal, y sacrificarlos a diferentes tiempos (0, 6, 24hs). El animal sacrificado en el día de la fecha fue el que había sido inyectado hacía 24hs. Luego de la extracción, también, sacamos el corazón del mismo. Una vez removido, el órgano fue lavado con PBS y fijado en formol al 10%. Finalmente, fue enviado al laboratorio de histología para que le realicen diferentes cortes en parafina, con el objetivo de realizar ensayos de inmunohistoquímica. Dichos ensayos los ejecutaremos en las próximas semanas.
Luego del prolongado receso, hoy, volvimos a extraer macrófagos peritoneales de un ensayo que consistía en inyectar LPS 0,1 mg/0,1ml de PBS, de forma interperitoneal, y sacrificarlos a diferentes tiempos (0, 6, 24hs). El animal sacrificado en el día de la fecha fue el que había sido inyectado hacía 24hs. Luego de la extracción, también, sacamos el corazón del mismo. Una vez removido, el órgano fue lavado con PBS y fijado en formol al 10%. Finalmente, fue enviado al laboratorio de histología para que le realicen diferentes cortes en parafina, con el objetivo de realizar ensayos de inmunohistoquímica. Dichos ensayos los ejecutaremos en las próximas semanas.
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