Día 10

17/9
Cuantificación de la actividad de MMP-9 por zimografía

El día de hoy realizamos una zimografía que es una técnica que permite estudiar la actividad de las metaloproteasas liberadas a un medio de cultivo celular. Se realizaron los geles de poliacrilamida para correr las muestras obtenidas en semanas anteriores. Dichos geles son similares a los que realizamos para Western Blot con la diferencia que se le agrega, al gel separador, gelatina. Una vez corridas las muestras (sobrenadante de macrófago: basal, LPS, PGJ, PGJ+LPS, MG-132, MG-132+LPS y suero de animales con 14 días de portación de tumor que se utilizó como control positivo), al gel se le hicieron lavados primero con PBS más tritón X100 y luego con PBS solo. Finalmente se colocó el gel en el buffer de incubación que contiene TRIS HCl, CaCl2 y agua destilada durante 24 hs. Luego de esto, lo que hicimos nosotras hoy, fue colocar los geles en el buffer de tinción que contiene coomasie blue, metanol, acético y agua durante 2hs a temperatura ambiente. En este paso, el gel quedará teñido completamente de color azul. Finalizado este tiempo, comienzará el desteñido del gel con una solución de acético y etanol durante 2 o 3hs. En el caso de que la muestra tenga MMP-9 se observará el gel teñido de azul con la aparición de bandas incoloras que corresponden a que la MMP-9 degradó la gelatina. Estos resultados los observaremos el jueves próximo.