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El día de hoy realizamos la técnica de Griess para la medición de nitritos. Para la determinación de óxido nítrico, que es un compuesto que participa durante un shock séptico y que tiene una vida media muy corta, se utiliza la determinación de nitritos en sobrenadantes de cultivos celulares, debido a que éstos son los productos finales estables.
Primero preparamos dos soluciones (A y B). Para la solución A, pesamos 500mg de ác. sulfanílico y lo disolvimos con 35ml de agua destilada y 15 ml de ácido acético. Para lograr su completa disolución, la calentamos a baño maría. La solución B estaba compuesta por 50 mg de naftilendiamina, 30 ml de ácido acético y 20 ml de agua destilada. A partir de éstas, se forma la solución final sumando la misma cantidad de cada solución. Para realizar una curva estandar de nitritos, diluimos una solución madre, dada por nuestra investigadora, de nitrito de sodio 2M. A partir de esta solución realizamos diferentes diluciones a las que, más tarde, les agregamos la solución A+B preparada. Pasados unos minutos, se empezó a ver una col
oración en las diferentes diluciones. Para obtener la curva de calibración, las leimos a 545nm en el lector de ELISA. A la derecha, podrán observar la curva de calibración obtenida.
El día de hoy realizamos la técnica de Griess para la medición de nitritos. Para la determinación de óxido nítrico, que es un compuesto que participa durante un shock séptico y que tiene una vida media muy corta, se utiliza la determinación de nitritos en sobrenadantes de cultivos celulares, debido a que éstos son los productos finales estables.
Primero preparamos dos soluciones (A y B). Para la solución A, pesamos 500mg de ác. sulfanílico y lo disolvimos con 35ml de agua destilada y 15 ml de ácido acético. Para lograr su completa disolución, la calentamos a baño maría. La solución B estaba compuesta por 50 mg de naftilendiamina, 30 ml de ácido acético y 20 ml de agua destilada. A partir de éstas, se forma la solución final sumando la misma cantidad de cada solución. Para realizar una curva estandar de nitritos, diluimos una solución madre, dada por nuestra investigadora, de nitrito de sodio 2M. A partir de esta solución realizamos diferentes diluciones a las que, más tarde, les agregamos la solución A+B preparada. Pasados unos minutos, se empezó a ver una col
oración en las diferentes diluciones. Para obtener la curva de calibración, las leimos a 545nm en el lector de ELISA. A la derecha, podrán observar la curva de calibración obtenida.Paralelamente, aplicamos el mismo procedimiento a muestras obtenidas con distintos tratamientos. Abajo se podrá observar un gráfico con la concentración de nitritos en cada uno de los tratamientos.
Como resultados observamos que el tratamiento de los macrófagos con LPS estimula significativamente la producción de nitritos, cuyo efecto depende del NF-kB (factor de trascripción) debido a que el pre-tratamiento con prostaglandina J (PGJ) y MG-132 bloquea dicho estimulo. Cabe recordar que PGJ y MG-132 son inhibidores de NF-kB.
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