Día 11

24/09

Inmunohistoquimica

Hoy empezamos con los ensayos de inmunohistoquimica que habiamos nombrado en el día 8. Esa vez la investigadora Eulalia De La Torre había enviado los corazones extraídos de los animales sacrificados al laboratorio de histología para que les realicen diferentes cortes en parafina (de entre 3 a 10 micrometros). En el día de hoy esos cortes ya fueron recibidos y pudimos empezar con los ensayos. Todo el ensayo lo hicimos en campana.
Los tratamientos a estudiar en este ensayo son:
corazon proveniente de un animal normal, corazones provenientes de animales estimulados durante 6 y 24hs con LPS.
El primer paso realizado fue el de rehidratación de los cortes con diferentes concentraciones de alcoholes. Hicimos 2 lavados con xilol, seguidos de 2 con alcohol etílico absoluto, 1 con alcohol 90%, 1 con alcohol 95%, 1 con alcohol 90%, 1 con alcohol 80%, 1 con alcohol 70%, y finalmente 1 con agua destilada. Cada lavado fue de 10 minutos.
Despues agregamos una solución 0,3% de agua oxigenada de 30 volumenes en PBS. Con 20 minutos de acción se logra la inhibición de la peroxidasa endógena.
Lavamos 2 veces con PBS durante 5 minutos y luego lavamos otros 5 minutos con PBS-T.
Lo último que hicimos en este día fue rodear la feta con un marcador llamado PAP pen, para que al 1er anticuerpo quede retenido en el círculo marcado. Entonces pusimos a incubar el 1er anticuerpo en PBS-T, en cámara húmeda y así quedará hasta mañana cuando la investigadora lo retire para seguir con el ensayo, realizando los siguientes pasos:
Lavar 2 veces durante 5 minutos con PBS y luego con PBS-T
Incubar con el 2do anticuerpo biotinilado en suero bloqueante, en cámara húmeda, durante 60 min.
Lavar 2 veces durante 5 minutos con PBS y luego con PBS-T.
Incubar con el 3er anticuerpo biotinilado en suero bloquente, en cámara húmeda, durante 60 min.
Lavar 2 veces durante 5 minutos con PBS.
Visualizar con diaminobencidina 400mg/l en Tris-HCl pH 7.6 + 4 gotas de agua oxigenada durante 10 minutos.
Lavar con agua destilada
Teñir con hematoxilina por 10 segundos (Contraticion)
Lavar con agua durante 10 minutos.
Deshidratar realizando los mismos lavados que al iniciar el ensayo pero en orden contrario.
Montar el porta con Entellan.

La próxima semana nos contará y veremos cuales fueron los resultados.