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DETERMINACIÓN DE PROTEÍNAS POR EL MÉTODO DE BRADFORD
En este día, utilizamos el método Bradford para determinar proteínas de diferentes muestras obtenidas.
El método de Bradford es una técnica colorimétrica basada en la capacidad que tienen las proteínas para unirse a ciertos colorantes.
El método de Bradford fue diseñado, como su nombre lo indica, por Bradford en 1976. El mismo se definió como sencillo, barato (solo se necesita un colorante), sensible (1-100mg) y rápido (la reacción finaliza a los 5 minutos y es estable por una hora). La absorbancia se lee a 595nm.
Blanco: Este tubo no contiene proteína, se reemplaza la muestra por agua y se le agrega el correspondiente volumen de reactivo. Se realiza para determinar la absorbancia del reactivo, este valor se descuenta de la absorbancia del resto de los tubos.
Curva de calibración: Para su realización se utilizará la solución testigo de Albúmina bovina de concentración conocida, 1 mg/ml. Con la medida de absorbancia de cada tubo y conociendo la cantidad de proteínas que contiene cada uno de los tubos, es posible realizar una curva de calibración (gráfico A595 vs mg de proteína). Es necesario realizarla cada vez que se procesen las muestras.
Muestra incógnita: se procesa en simultáneo y en las mismas condiciones que la curva de calibración. El tubo contiene la muestra y la misma cantidad de reactivos que los anteriores. Para conocer la cantidad de proteínas de la muestra (mg), se determina la absorbancia de la misma y se interpola en la curva de calibración.
La curva la realizamos tomando de 2,5 a 40 ml de la solución madre o testigo y luego la llevamos a 50 ml con H2Od. De las muestras colocamos 10 ml y los llevamos a 50 ml, siempre con H2Od. Finalmente a todos los tubos, se les agregó 950 ml del reactivo de Bradford.
El método de Bradford es una técnica colorimétrica basada en la capacidad que tienen las proteínas para unirse a ciertos colorantes.
El método de Bradford fue diseñado, como su nombre lo indica, por Bradford en 1976. El mismo se definió como sencillo, barato (solo se necesita un colorante), sensible (1-100mg) y rápido (la reacción finaliza a los 5 minutos y es estable por una hora). La absorbancia se lee a 595nm.
Blanco: Este tubo no contiene proteína, se reemplaza la muestra por agua y se le agrega el correspondiente volumen de reactivo. Se realiza para determinar la absorbancia del reactivo, este valor se descuenta de la absorbancia del resto de los tubos.
Curva de calibración: Para su realización se utilizará la solución testigo de Albúmina bovina de concentración conocida, 1 mg/ml. Con la medida de absorbancia de cada tubo y conociendo la cantidad de proteínas que contiene cada uno de los tubos, es posible realizar una curva de calibración (gráfico A595 vs mg de proteína). Es necesario realizarla cada vez que se procesen las muestras.
Muestra incógnita: se procesa en simultáneo y en las mismas condiciones que la curva de calibración. El tubo contiene la muestra y la misma cantidad de reactivos que los anteriores. Para conocer la cantidad de proteínas de la muestra (mg), se determina la absorbancia de la misma y se interpola en la curva de calibración.
La curva la realizamos tomando de 2,5 a 40 ml de la solución madre o testigo y luego la llevamos a 50 ml con H2Od. De las muestras colocamos 10 ml y los llevamos a 50 ml, siempre con H2Od. Finalmente a todos los tubos, se les agregó 950 ml del reactivo de Bradford.
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